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應用范圍
細菌內毒素限量檢查法試驗介紹
Date: 2018-10-20 15:13:23

韋冬苗(講解)  董光宴(審校)
(湛江博康海洋生物有限公司,湛江524094)
      編者按:細菌內毒素檢查法為無菌注射藥品的常規檢查方法,該方法已開展二十多年,為保障藥品安全做出了重大貢獻。二十多年來國內已培養了大量的、經驗豐富的專業試驗人員,他們的辛勤努力為細菌內毒素檢查法的發展奠定了堅實的基礎。因每年都有許多新同志加入到細菌內毒素檢查法這個隊伍中來,為了幫助他們正確理解該方法,規范他們的操作行為,提高他們的專業素養,《細菌內毒素檢查法應用與論壇》將從本期開始陸續介紹有關細菌內毒素檢查法的基礎知識。通過學習與交流,我們希望對他們的成長有所幫助,同時也為了糾正一些已經發生的部分不正確、不規范的行為。因作者水平有限,其中不足之處請讀者諒解! 

      一、試劑
      1、鱟試劑:
  • 具有國家批準文號,并依法檢驗合格。 如:湛江博康海洋生物有限公司,衛藥準字(88)SJ-04。
  • 市場供應穩定,企業管理規范,生產條件符合要求;
  • 質量穩定,廣大客戶認可,未出現過漏檢;
  • 鱟試劑一般按標示溫濕度貯藏。湛江博康海洋生物有限公司提供的鱟試劑貯藏條件為,溫度:20℃以下,建議濕度45%~70%,也可以貯藏在2℃~10℃的冷處,但建議試驗前2小時將鱟試劑移至室溫環境;避免將鱟試劑貯藏在濕度小于45%的環境中,這種環境玻璃安瓿易產生靜電,吸附鱟試劑粉末,導致鱟試劑粉末無法全部落入瓶底。
      2、細菌內毒素檢查用水:
  • 鱟試劑生產廠家配套,要求其PH值應在6.0~8.0之間,檢查用水系指內毒素含量小于0.015EU/ml(用于凝膠法)或0.005EU/ml(用于光度測定法)且對內毒素試驗無干擾作用的滅菌注射用水;
  • 其原料必須為滅菌注射用水,不得選用超純水;
  • PH值應在6.0~8.0之間;
  • 無干擾作用,最好適用于國內外所有廠家的鱟試劑;
  • 與相同廠家的鱟試劑、細菌內毒素工作品配套使用;
  • 細菌內毒素檢查用水貯藏在常溫即可,無特殊條件要求。開啟后的細菌內毒素檢查用水必須一次性使用,不得保存重復使用。細菌內毒素檢查用水直接從包裝容器內取出使用,不得用其它容器分裝使用。
3、細菌內毒素標準品:
  • 細菌內毒素國家標準品系自大腸埃希菌提取精制而成,用于標定、復核、仲裁鱟試劑靈敏度和標定細菌內毒素工作標準品的效價。中國食品藥品檢定研究院提供,如:150800-201601,活性單位:9000EU/支。
  • 細菌內毒素工作標準品系以細菌內毒素國家標準品為基準標定其效價,用于試驗中鱟試劑靈敏度復核、干擾試驗及各種陽性對照。中國食品藥品檢定研究院提供,如:150601-201784,活性單位:80EU/支。
  • 細菌內毒素工作品系以細菌內毒素國家標準品為基準標定其效價,用于試驗中陽性對照和樣品陽性對照。湛江博康海洋生物有限公司生產, 如:1809200,活性單位:10EU/支。
注意:
  • 細菌內毒素標準品的開啟只能在安瓿的易折點上部開啟內毒素,不能沿易折點開啟,防止振蕩過程中內毒素溶液與封口膜接觸,污染標準品溶液。
  • 只能取1ml的細菌內毒素檢查用水復溶細菌內毒素工作標準品。
  • 若使用的為細菌內毒素國家標準品,可按其使用說明書中的方法將其稀釋至規定濃度后分裝保存(濃度為9000EU的細菌內毒素標準溶液在4℃條件下可保存7天;或者將復溶后的細菌內毒素標準溶液制成2000EU/ml,每0.3ml分配于除去外源性內毒素的試管中,用封口膜將管口封嚴,管口垂直向上,然后立即貯藏在-20℃冰箱中可保存3周。)。若為細菌內毒素工作標準品,為一次性使用,不得分裝保存。 
  • 錯誤使用:使用內毒素工作標準品標定鱟試劑靈敏度;使用廠家的內毒素復核鱟試劑靈敏度;廠家內毒素交叉復核鱟試劑靈敏度;使用廠家的內毒素做干擾實驗。
  • 稀釋后的細菌內毒素溶液靜置時間超過10分鐘,再用前在旋渦混合器上振搖1分鐘,放置4小時以上的內毒素溶液應丟棄。稀釋后的細菌內毒素溶液效價較低,由于保存不當或保存的容器未除熱原等,內毒素溶液容易被污染。同時,細菌內毒素溶液長期放置其效價通常會下降,因此再次使用時,實驗結果可能會有偏差,不建議保存后在使用。
  • 細菌內毒素工作標準品如標示有效期,在效期內使用;中國食品藥品檢定研究院提供的細菌內毒素國家標準品150800-201601未標示有效期,按國家文件要求使用;中國食品藥品檢定研究院提供的細菌內毒素工作標準品未標示有效期,建議2年內使用。
  • 細菌內毒素標準品一般按標示溫度條件貯藏,建議所有細菌內毒素標準品貯藏在-10℃以下。
      二、試驗器材
      1、玻璃移液管(或吸嘴)和玻璃試管  建議大家選用本公司提供的一次性耗材。無熱原耗材是一種在此行業中被鑒定為無內毒素和β-葡聚糖污染的產品,其中包括, 無熱原試管、無熱原移液器吸頭。這些產品可以給您的工作帶來很大方便,另外,當實驗出現誤差時可首先排除器皿方面的因素,很快分析判斷出誤差原因。自行處理玻璃移液管和玻璃試管按以下要求和規程處理:2015年版《中國藥典分析檢測技術指南》細菌內毒素檢查法“3 實驗準備”規定:
  • 3.1.1 玻璃器皿的洗滌 將玻璃器皿放入鉻酸洗液或其他熱原滅活劑或清洗液中充分浸泡,然后取出將洗液空干,用自來水將殘留洗液徹底洗凈,再用蒸餾水反復沖洗三遍以上,空干后放入適宜的密閉金屬容器中或用錫箔紙包好后再放入金屬容器內,放置入烤箱。
  • 3.1.2 除去玻璃器皿表面可能存在的外源性內毒素   玻璃器皿置烤箱后,將烤箱調至 250℃,待烤箱溫度升至設定的溫度后開始計時,干烤30分鐘以上。達到規定時間后,關斷電源,待烤箱溫度自然降至室溫。在不打開金屬容器的情況下,可在兩天內使用;如果玻璃器皿用錫箔紙包裝,在不打開包裝的情況下可在兩周內使用,否則須再次干烤除去可能存在的外源性內毒素。
      按照2015年版《中國藥典》凡例第二十二條規定“試驗用水,除另有規定外,均系指純化水。”應該特別注意,該規程明確規定最后沖洗玻璃器皿必須“用蒸餾水沖洗。”有的客戶使用反滲透制備的純化水沖洗試驗用玻璃器皿,結果試驗中所有的陽性對照都為陰性,復核鱟試劑靈敏度時試驗結果誤差較大,這主要是由于純化水和蒸餾水的制備方法不同所造成的。由于制備方法不同,純化水中存在的陰陽離子經250℃高溫干烤不可能被破壞,這些離子對鱟試劑酶反應有較強的抑制作用。
  • 常見錯誤:部分客戶使用純化水沖洗試驗用玻璃器皿,更有甚者居然只用自來水沖洗,然后干烤以除去玻璃器皿表面可能存在的外源性內毒素。這樣處理玻璃器皿做細菌內毒素實驗的主要現象:陽性對照不成立,靈敏度復核結果也不成立。這是目前所知陽性對照不成立和靈敏度復核結果不成立的主要原因。
  • 解決辦法:取一個潔凈的盆用蒸餾水反復沖洗,洗凈后盛一盆蒸餾水將“用自來水洗凈”的玻璃器皿放入盆中,反復沖洗,這樣為沖洗一遍,洗完后將水倒凈另盛一盆蒸餾水重洗,如此沖洗最少三遍。為了保證試驗結果的準確性和檢驗報告的權威性,我們應該嚴格遵守操作規程,用蒸餾水沖洗鱟試驗用玻璃器皿。
      2、恒溫箱
      目前常用的恒溫箱為水浴箱和干式恒溫箱,能準確控制溫度二者都可以使用。推薦一款小巧輕便的干式恒溫儀ET-96內毒素凝膠法測定儀,該儀器采用固體鋁板加熱;提供96個檢測孔,可直接插入鱟試劑安瓿,也可插入試管;96個檢測孔分為12組,單獨計時;溫度控制精確0.1℃。無論采用哪種恒溫箱,鱟試劑都必須用醫用膠布或封口膜封口,鱟試劑不得敞口放置入恒溫器內。封口的目的是為了防止放置灰塵、水滴等落入鱟試劑內造成污染,同時也為了防止鱟試劑安瓿內水分的揮發,避免假陽性的產生。禁止使用生化培養箱作為細菌內毒素試驗的恒溫箱,避免假陰性的產生。
      3、旋渦振蕩器。
      4、其它:消毒棉球、試管架、剪刀和封口膜等。
      三、抽樣
      在配制罐或灌裝前的儲罐中的藥液的微生物和內毒素污染可視為均勻的,但經過灌裝后,就有可能存在污染不均勻的情況。
      無菌(或內毒素)檢査的樣品除另有規定外,一般采取隨機抽樣原則進行取樣。隨機抽樣中,對分批應特別注意。對于一個配制批次分多個滅菌柜/次滅菌的情況,通常應對各個滅菌柜/次分別取樣,進行無菌(內毒素)檢查。限于抽樣原理,無菌(內毒素)檢查無法有效發現低污染概率的缺陷,在遵循隨機取樣的原則下,還應考慮產品生產工藝、無菌檢查法的特點及微生物污染的方式,抽取典型產品組成樣本進行檢驗。
      四、環境要求
      2010年版藥品GMP實施指南要求細菌內毒素實驗室:溫度18~26℃,濕度45%~75%。為保證實驗結果的準確性,防止污染,內毒素檢查實驗應在密閉的潔凈室中或密閉實驗室的超凈工作臺下進行。
      1、密閉的潔凈室中或密閉實驗室的超凈工作臺
      細菌內毒素檢測人員應經過嚴格的培訓,并應配備相應的防護設施(如穿防護服、戴口罩、頭套等)。超凈工作臺盡可能選擇水平氣流式工作臺,注意消毒劑的影響。
      2、實驗室溫度
      將細菌內毒素工作標準品用細菌內毒素檢查用水稀釋成2λ,進行鱟試驗,然后分別放置于25、28、31、34、37℃水浴保溫。實驗中觀察到凝膠形成的速度隨著溫度的升高而加快。從實驗可以看出,溫度對鱟試劑的靈敏度影響很大,保溫溫度在25~37℃之間,隨著溫度的升高,反應速度也升高。
      將細菌內毒素工作標準品用細菌內毒素檢查用水稀釋成2λ,進行鱟試驗,37℃保溫,分別在10、20、30、40、50、70min時觀察,發現凝膠的形成狀態隨著時間的延長而堅固。
      因此夏天室溫較高,如果試驗操作時間太長,細菌內毒素與鱟試劑混合液不等進入反應儀器反應已開始,實際反應時間超過1小時。由于室溫不同,冬夏季節、南北地區之間的操作誤差將會很大,即使在25℃準室溫下操作,操作時間拖得過長,細菌內毒素含量較高時,測定誤差也不會小。
      3、實驗室濕度
      鱟試劑是一種無菌凍干產品,這類產品有一明顯特性即吸潮。當實驗室濕度大于80%時,鱟試劑開啟后較易吸潮,空氣中水分內含有何種成份無法預知,吸濕后可能產生何種影響也無法預知。根據經驗,當空氣濕度較大時,鱟試劑靈敏度復核值要大于標示值,標示值為0.25EU/ml的鱟試劑復核結果可能高于0.125EU/ml,有時甚至達到0.06EU/ml。當空氣濕度較小低于40%時,鱟試劑安瓿內溶液較易揮發,造成細菌內毒素濃縮,產生假陰性結果。這也是我們要求使用干式恒溫箱時,鱟試劑必須封口的原因之一。
      五、供試品溶液的制備
      1、供試品需進行復溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。
      第一類、易溶注射用無菌注射藥(固體)或無菌原料藥。
  • 固體類可溶性無菌原料藥為了保證取樣的科學性、準確性和代表性,稱樣量應大于100mg。
  • 無菌原料藥需要檢測內毒素時,為了檢驗結果與生產工藝一致,必須依照標準扣除水分和雜質。
  • 注射用無菌注射藥加適量細菌內毒素檢查用水溶解稀釋即可。
      第二類、注射用無菌注射藥(液體)。
  • 直接用細菌內毒素檢查用水稀釋即可。
      第三類、微溶或不溶性注射用無菌注射藥(固體)
  • 參照2015版《中國藥典》正文P1462《酪氨酸》檢查項【細菌內毒素】執行。
  • 難溶性固體藥品為了保證取樣的科學性、準確性和代表性,稱樣量應大于1g。
  • 難溶性固體藥品為了建立細菌內毒素檢查方法,可以采用以下幾種方法:
    • ① 洗滌法,取上清液依法檢測,如酪氨酸等;
    • ② 超聲波助溶法,如放線菌素D、注射用放線菌素D等;
    • ③ 加熱助溶法,如苯丙氨酸、色氨酸等;
    • ④酸堿互溶法,如酸性哌拉西林用1mol/L氫氧化鈉溶液適量使溶解等。
      用戶可根據供試品具體情況選用適宜的方法。
      第四類、醫療器械
      按照國標GB/T 14233.2-2005《醫用輸液輸血、注射器具檢驗方法》要求:根據產品標準規定的細菌內毒素限值確定浸提介質體積,選用下列適宜方法制備供試液:
  • a)管類和容器類器具用細菌內毒素檢查用水浸泡器具內腔,在(37±1)℃恒溫箱中浸提不少于1h;
  • b)小型配件或實體類器具置無熱原玻璃器具內,加入細菌內毒素檢查用水振搖數次,在(37±1)℃恒溫箱中浸提不少于1h。
      企業生產實驗用器具器皿可參照此標準執行。
      2、確定最大有效稀釋倍數
      舉例:
      1、硫酸妥布霉素注射液:C= 40mg/ml,L= 2.0EU/mg(2015年版《中國藥典》P516)
      當用靈敏度為0.125EU/ml 的鱟試劑時:
      MVD=(40×2)/ 0.125
              =640倍  
      2、右旋糖酐70葡萄糖注射液 L= 0.50EU/ml(2015年版《中國藥典》P171)
      當用靈敏度為0.125EU/ml 的鱟試劑時:
      MVD=(1.0× 0.50)/0.125
              =4倍 
      3、頭孢噻肟鈉(原料):水份<6%,含量≥86%,L= 0.05EU/mg(250年版《中國藥典》P297)
      當用靈敏度為0.125EU/ml 的鱟試劑時:稱得樣品126.8mg
      最小有效稀釋濃度c=λ/L 
                                       =0.125/0.05
                                       =2.5mg/ml
      計算純頭孢噻肟鈉的量:
          = 126.8mg×(1-6% ) × 86% 
          =106.60mg
      用5.33ml的BET水復溶,得濃度C=20mg/ml,在此基礎上稀釋8倍即可。
      六、鱟試劑靈敏度復核試驗 
      1、做鱟試劑靈敏度復核試驗的目的?
      答:2015版《中國藥典》規定“當使用新批號的鱟試劑或試驗條件發生了任何可能影響檢驗結果的改變時,應進行鱟試劑靈敏度復核試驗。”2015版《中國藥典分析檢測技術指南》規定“鱟試劑靈敏度復核的目的不僅是考察鱟試劑的靈敏度是否準確,也是考查檢驗人員操作方法是否正確及實驗條件是否符合規定。”
      因此要求每個實驗室在使用一批新的鱟試劑進行供試品干擾實驗或供試品細菌內毒素檢查前必須進行鱟試劑靈敏度復核實驗。 細菌內毒素國家標準品與細菌內毒素工作標準品之間或細菌內毒素工作標準品與細菌內毒素工作標準品之間的生物效價存在一定的誤差,用不同細菌內毒素標準品復核同一批鱟試劑靈敏度時可能存在一定的誤差。
      中國藥典要求“當λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)時,方可用于細菌內毒素檢查,并以標示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。”試驗結果只要在這合格范圍內表示鱟試劑標示靈敏度準確。
      2、操作
      2.1、試劑
  • 鱟試劑(生產單位:湛江博康海洋生物有限公司;批號:1808272;靈敏度:0.125EU/ml;規格:0.1ml/支)
  • 檢查用水(生產單位:湛江博康海洋生物有限公司;批號:1808200;規格:5ml/支)
  • 細菌內毒素工作標準品(活性:80EU/支;批號:201784;中國食品藥品檢定研究院提供)  
      2.2、操作
      2.2.1細菌內毒素標準溶液的制備
      取細菌內毒素工作標準品(201784)一支,輕彈瓶壁,使粉末落入瓶底,然后用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕,75%酒精棉球擦拭后啟開,啟開過程中應防止玻璃屑落入瓶內。
      按照標準品說明書,加入規定量的細菌內毒素檢查用水1.0ml溶解其內容物,用封口膜將瓶口封嚴,置旋渦混合器上混合15分鐘。然后進行稀釋,制備成4個濃度的細菌內毒素標準溶液,即2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ(0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.0625EU/ml和0.03125EU/ml,λ為所復核的鱟試劑的標示靈敏度),每稀釋一步均應在旋渦混合器上混合30秒鐘(詳細過程請參見標準品使用說明書)。
      2.2.2 待復核鱟試劑的準備
      取規格為0.1ml/支的鱟試劑18支,輕彈瓶壁使粉末落入瓶底,用砂輪在瓶頸輕輕劃痕,75%酒精棉球擦拭后啟開備用,防止玻璃屑落入瓶內。每支加入0.1ml檢查用水溶解,輕輕轉動瓶壁,使內容物充分溶解,避免產生氣泡。若待復核鱟試劑的規格不是0.1ml/支時,取若干支按其標示量加入檢查用水復溶,充分溶解后將鱟試劑溶液混和在一起,然后每0.1ml分裝到10mm×75mm凝集管中,要求至少分裝18管備用。 
      2.2.3 加樣
      將已充分溶解的待復核鱟試劑18支(管)放在試管架上,排成5列,其中4列4支(管),每支分別加入0.1ml 2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的內毒素標準溶液;1列2支(管),每支分別加入0.1ml檢查用水。
      2.2.4 加樣結束后,將鱟試劑用封口膜封口,輕輕振動混勻,避免產生氣泡,連同試管架放入37℃±1℃水浴或適宜恒溫器中,試管架保持水平狀態,保溫60分鐘±2分鐘。
      2.2.5 觀察并記錄結果。將試管架從水浴中輕輕取出,避免振動,將每管拿出緩緩倒轉180°觀察,若管內形成凝膠,并且凝膠不變形,不從管壁滑脫者為陽性,記錄為(+);未形成凝膠或形成的凝膠不堅實、變形并從管壁滑脫者為陰性,記錄為(-)。保溫和拿取試管過程應避免受到振動造成假陰性結果。
      2.3 實驗結果計算
      如最大濃度 2.0λ 4管均為陽性,最低濃度 0.25λ 4管均為陰性,陰性對照為陰性時實驗為有效,按下式計算反應終點濃度的幾何平均值即為鱟試劑靈敏度的復核結果(λc)
λc=antilg( X/4 )
      式中X為反應終點濃度的對數值(Lg)。反應終點濃度是系列遞減的內毒素標準溶液中最后一個呈陽性結果的濃度。
      2.4 結果判斷
      當λc 在0.5λ~2.0λ(包括0.5λ和2.0λ)時判定該批鱟試劑靈敏度復核合格,可用于干擾實驗和供試品細菌內毒素檢查,并以λ(標示靈敏度)為該批鱟試劑的靈敏度。
      設待復核鱟試劑的靈敏度為0.125EU/ml。實驗結果如下:
      λc=antilg( X/4)
          =antilg(lg0.125+lg0.125+lg0.125+lg0.0625)/4
          = 0.10( EU/ml)
      λc 在0.5λ~2.0λ范圍內,符合規定。并且該批鱟試劑的靈敏度為標示靈敏度0.125EU/ml。
      ※ 鱟試劑靈敏度復核試驗結果全部為陰性主要有三個方面的原因祥見本書《陽性對照不成立的原因分析及解決方法》。
      七、限量檢查
      例如:右旋糖酐70葡萄糖注射液 L= 0.50EU/ml(2015年版《中國藥典》P171),最大有效稀釋倍數MVD為4倍,TAL(0.125EU/ml)。
      1、 按要求制備陽性對照、陰性對照、樣品管和樣品陽性對照。
      2、制備方法
      首先,將樣品右旋糖酐70葡萄糖注射液稀釋到2倍、4倍備用。
      2.1、供試品陽性對照PPC:(做2管)
      取右旋糖酐70葡萄糖注射液的2倍稀釋液和濃度為0.50EU/ml的內毒素稀釋液各0.3ml混合均勻,取該混合液0.1ml加入已經復溶好的鱟試劑中即可。
      2.2、陽性對照PC:(做2管)
      取0.1ml濃度為0.25EU/ml的內毒素稀釋液加入已經復溶好的鱟試劑中即可。
      2.3、供試品溶液:(做2管)
      取0.1ml右旋糖酐70葡萄糖注射液的4倍稀釋液加入已經復溶好的鱟試劑中即可。
      2.4、陰性對照:(做2管)
      取0.1ml細菌內毒素檢查用水加入已經復溶好的鱟試劑中即可。
      3、結果判斷 
      保溫60分鐘±2分鐘后觀察結果。若陰性對照溶液D的平行管均為陰性,供試品陽性對照B的平行管均為陽性,陽性對照溶液C的平行管均為陽性,試驗有效。
 
(本文完)

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