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細菌內毒素檢查中常遇的問題及解決方法
Date: 2018-09-18 14:54:05

韋冬苗(綜述) 董光宴(審校)

(湛江博康海洋生物有限公司,湛江524094)

    從中國藥典1990版收載細菌內毒素檢查法至今已有二十多年。正確理解藥典內容非常重要,本文是筆者對細菌內毒素檢查法的理解或想法,認為有必要對這些相關問題加以探討,以供參考。
1. 鱟試劑的靈敏度值與樣品細菌內毒素限值一致進行試驗是最佳選擇嗎?如10%葡萄糖注射液選用0.50EU/ml的鱟試劑,注射用水選用0.25EU/ml的鱟試劑。
    不是!選擇鱟試劑的靈敏度值等于樣品原液細菌內毒素限值進行試驗,從一般的認識角度看,其唯一好處是可以節省對樣品的稀釋。但其不利之處有二:①因供試品溶質濃度和PH值等因素影響,增加了供試品陽性對照(PPC)管操作的難度;②無法避免樣品原液如藥液中保留了過濾材料、或不可預見的管道溶出物等因素可能造成供試品陽性對照(PPC)管不凝的情況,導致試驗無效,結果“最佳方案”反而造成時間、試劑、藥品等的浪費,耽誤工作。做過細菌內毒素檢查試驗的同志都知道,倍倍稀釋法是做供試品陽性對照(PPC)管最簡便、最規范的方法。因此,綜合試劑成本、試驗操作規范等因素,減少樣品溶液對細菌內毒素試驗的干擾,建議選擇更靈敏的鱟試劑如0.125EU/ml,并對樣品原液作適宜稀釋后進行試驗。
2、細菌內毒素檢測取樣量/檢驗量是多少?
    內毒素檢査的樣品除另有規定外,一般采取隨機抽樣原則進行取樣。隨機抽樣中,對分批應特別注意。對于一個配制批次分多個滅菌柜/次滅菌的情況,通常應對各個滅菌柜/次分別取樣,進行內毒素檢查。
內毒素檢查中實際遇到過,同一批檢品但不同瓶用同一廠家的同一批鱟試劑檢查結果不同,而且即使換人及換鱟試劑進行檢查這種不同的結果仍可重復。排除操作對樣品污染的可能后,對樣品進行細菌內毒素污染量測定,發現兩瓶大輸液之間的細菌內毒素污染量相差4倍以上。可見細菌內毒素污染的瓶間差異客觀存在。這一現象也提示我們,限于抽樣原則,內毒素檢查無法有效發現低污染概率的缺陷,在遵循隨機取樣的原則下,還應考慮產品生產工藝、及內毒素污染的方式,抽取典型時間節點的產品進行檢驗,可避免熱原反應的漏檢。
3、細菌內毒素檢查用水,是必須購買的嗎?
    2010年版《中國藥典》凡例第二十二條規定“試驗用水,除另有規定外,均系指純化水。”同時2010年版《中國藥典》及《中國藥品檢驗標準操作規范》明確規定,細菌內毒素檢查實驗必須使用“細菌內毒素檢查用水”,那么試驗中我們就不能用滅菌注射用水代替“細菌內毒素檢查用水”。細菌內毒素檢查用水系指內毒素含量小于0.015EU/ml(凝膠法)或0.005EU/ml(光度測定法)且對內毒素試驗無干擾作用的滅菌注射用水。
細菌內毒素檢查用水與滅菌注射用水比較有以下區別:
    3.1  內毒素含量:滅菌注射用水要求較低0.25 EU/ml,本公司細菌內毒素檢查用水要求內毒素﹤0.003 EU/ml。細菌內毒素檢查用水用于試驗,無論凝膠法還是定量法其內毒素可以忽略不計,但滅菌注射用水由于內毒素標準要求較低,其內毒素不能忽略。滅菌注射用水用于鱟試驗,由于滅菌注射用水與樣品中內毒素的疊加可能造成假陽性結果,給企業帶來不必要的經濟損失。
    3.2  PH值:滅菌注射用水PH值要求5.0~7.0,本公司細菌內毒素檢查用水要求PH值要求6.0~8.0。細菌內毒素檢查用水PH值6.0~8.0更有利于細菌內毒素與鱟試劑的反應。
    3.3  無干擾作用:細菌內毒素檢查用水要求對內毒素試驗無干擾作用,而滅菌注射用水無此標準要求。滅菌注射用水可能有抑制作用,造成假陰性結果,有時內毒素超標而未檢出,由于漏檢導致的輸液反應可能給企業帶來滅頂之災。
4、注射用水細菌內毒素檢查需每批都做供陽對照嗎?
    要做的,供陽的作用是為了核實供試品中是否有抑制鱟試劑凝聚的物質,以證明供試品溶液的結果準確。注射用水是生產注射藥品的溶媒,我們必須保證注射用水內毒素檢測結果的準確可靠。如果不做供試品陽性對照,一旦出現假陰性,我們無法預知,生產出來的成品中內毒素是否合格?成品生產出來仍然沒有發現假陰性,不合格產品流入市場造成嚴重輸液反應,將直接威脅臨床患者的生命安全。
5、細菌內毒素工作品用檢查用水稀釋后,實驗剩下的可以保存再利用嗎?
    稀釋后的內毒素溶液靜置時間超過10分鐘,使用前應在旋渦混合器上重新振搖1分鐘,放置4小時以上的內毒素溶液應丟棄。稀釋后的內毒素溶液效價較低,長期放置其效價通常會下降,因此再次使用時,實驗結果可能會有偏差,一般情況下,內毒素工作品價格不貴,不建議保存后再利用。
    總結:要保證細菌內毒素檢查結果的準確性,簡單來說做好三個方面工作:①首先要保證實驗器材可靠,否則實驗是百分之百失敗;②保證標準品稀釋準確,才能保證實驗結果準確;③加樣準確,這是實驗的基礎,沒有這個基礎,實驗準確性、藥典規定、SOP等無從談起。
    細菌內毒素檢查項關系到人的生命安全,藥典和SOP對其實驗過程有嚴格的規定,每位從業人員應該對其仔細閱讀,深刻理解,應對鱟試驗反應原理、影響因素等有比較深入了解,這樣才能解決試驗中出現的問題,保證實驗結果準確,確保傷病員用藥安全。

 

(本文完)

作者單位:湛江博康海洋生物有限公司

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