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陽性對照不成立的原因分析及解決方法
Date: 2018-09-18 15:18:54

韋冬苗(綜述) 董光宴(審校)
(湛江博康海洋生物有限公司,湛江524094)
    在工作中,作者時有接到咨詢電話——細菌內毒素試驗中為什么陽性對照不凝?經詳細了解具體情況后,發現類似問題,成了一個經常發生的困擾大家的一種實驗現象;作者對這個問題的產生原因進行分析、歸納并提供相關解決辦法,供大家參考。
    作者認為細菌內毒素試驗中陽性對照不凝,主要有三個方面的原因。
1  試劑問題(包括內毒素和鱟試劑)
    當鱟試劑、內毒素標準品標示值超出偏差范圍,或內毒素稀釋使用不當,或細菌內毒素和檢查用水為不同廠家產品交叉使用,可能導致陽性對照不成立。有的用戶使用鱟試劑廠家提供的細菌內毒素標準品做陽性對照,但在試驗時往往使用的鱟試劑、檢查用水不是同一廠家的,這是目前陽性對照不成立的主要原因之一。我們在工作中發現,湛江博康海洋生物有限公司提供的細菌內毒素標準品、檢查用水及試驗耗材適用于國內、國外所有供應商生產的鱟試劑。許多客戶在實驗時忽略了這個問題,導致陽性對照不成立或靈敏度試驗全部為陰性,查其原因,最終發現有的鱟試劑供應商提供的細菌內毒素標準品、檢查用水及試驗耗材不適用于其它廠家的鱟試劑,特別是鱟試劑“合資”企業的檢查用水,這種現象最突出。
2  實驗條件問題
    2.1   器皿洗滌問題    2010年版《中國藥品檢驗標準操作規范》311頁細菌內毒素檢查法“實驗準備”規定:“將玻璃器皿放入鉻酸洗液或其他熱原滅活劑或清洗液中充分浸泡,然后取出將洗液瀝干,用自來水將殘留洗液徹底洗凈,再用蒸餾水反復沖洗三遍以上,空干后放入適宜的密閉金屬容器中或用錫箔紙包好后再放入金屬容器中,放置烤箱中,除去玻璃器皿表面可能存在的外源性內毒素。”

    按照2010年版《中國藥典》凡例第二十二條規定“試驗用水,除另有規定外,均系指純化水。”應該特別注意,該規程明確規定最后沖洗玻璃器皿必須“用蒸餾水沖洗。”有的客戶使用反滲透制備的純化水沖洗試驗用玻璃器皿,結果試驗中所有的陽性對照都為陰性,復核鱟試劑靈敏度時試驗結果誤差較大,這主要是由于純化水和蒸餾水的制備方法不同,其水質量存在天壤之別。由于制備方法不同,純化水中存在的陰陽離子經250℃高溫干烤不可能被破壞,這些離子對鱟試劑酶反應有較強的抑制作用,導致陽性對照不成立,靈敏度復核結果也不成立。這是目前所知陽性對照不成立和靈敏度復核結果不成立的主要原因。
    2.2  洗液問題   5%重鉻酸鉀硫酸洗液配置應密閉保存,禁止直接暴露在空氣中,洗液一旦變綠,表示鉻酸已經還原,失去了氧化能力,不宜再用。
    2.3  恒溫箱溫度和保溫問題   個別單位發現陽性對照管不凝后,把鱟試劑及內毒素拿到本公司實驗室再進行試驗,結果陽性對照管凝得很好。但是,當我們到外單位就地進行細菌內毒素試驗時,卻在2個實驗室發現過陽性對照管不凝的情況。其原因是保溫環節出現問題最為常見。一次是保溫過程中水浴箱電源插座接觸不良,恒溫不能保證;另一次是某單位使用無蓋式恒溫水浴鍋代替有蓋式電熱恒溫水浴箱,水表層的溫度可能并未達到37℃。由于鱟試劑的成膠時間與溫度在一定的范圍內呈負相關。溫度偏低將使成膠時間延長,在規定的時間里陽性對照管不凝也就不足為奇了。造成水浴溫度實際偏低的另一原因,還可能是因為實驗者把溫度計放在發熱管附近監測反應溫度所致。我們主張采用電熱恒溫水浴箱上的水銀溫度計監測反應溫度。精確的控溫也是試驗取得準確結果的重要保證。
    2.4  保溫設備問題   2010年版《中國藥品檢驗標準操作規范》要求細菌內毒素檢查法恒溫設備可用“恒溫水浴箱或適宜的恒溫器,可設定保溫溫度在37℃±1℃”。部分實驗室將鱟試劑放在微生物培養箱或鼓風電熱恒溫箱中37℃恒溫60分鐘,觀察結果時發現陽性對照不成立,靈敏度復核結果也不成立。2010年版《中國藥品檢驗標準操作規范》提示“由于凝集反應是不可逆的,所以在反應過程中及觀察結果時應注意不要使試管受到振動,以免使凝膠破碎產生假陰性結果。”部分客戶堅持認為反應過程中及觀察結果時他們沒有使試管受到振動,但忽略了微生物培養箱或鼓風電熱恒溫箱中的熱空氣一直處于循環狀態,鱟試劑安瓿很輕,在熱空氣循環狀態下安瓿一直處于振動狀態,這是典型的假陰性結果。我們推薦一款儀器,ET-96內毒素凝膠法測定儀,該儀器專門用于細菌內毒素檢查的凝膠法試驗,完全符合《中國藥典》要求,儀器提供96個檢測孔,可直接插入鱟試劑安瓿,96個檢測孔分為12組,每組單獨定時,樣品加樣后直接放入儀器,并開始60分鐘的定時保溫,避免不同樣品加樣后放入保溫裝置的時間差帶來的不準確性。
    2.5  實驗室環境   為保證實驗結果的準確性,防止污染,內毒素檢查實驗應在密閉的潔凈室中或密閉實驗室的超凈工作臺下進行。細菌內毒素試驗盡可能設立獨立實驗室,不要與其它試驗共用同一實驗室。
3  操作問題。
    3.1  內毒素開啟   細菌內毒素標準品只能在安瓿的易折點上部開啟內毒素安瓶,不能沿易折點開啟,防止振蕩過程中內毒素粘在封口膜上。封口膜或醫用膠布成份,與內毒素溶液接觸后,有部分內溶物溶于溶液中,產生增強或抑制作用。
    3.2  內毒素振蕩問題   此外,操作上我們還應注意內毒素的溶解稀釋過程要按藥典的規定進行,振蕩的時間及強度要保證,使內毒素溶液均勻穩定,內毒素分子充分分散。
    3.3  鱟試劑開啟時間   操作時嚴格按操作規程進行,安瓿開啟前應先用酒精棉球擦拭曲頸部,將頸部折斷,防止碎玻屑掉入安瓿內。在鱟試劑的溶解、樣品的稀釋及加樣時,取樣均應準確。如果一人獨立完成試驗,可先稀釋配制好內毒素標準溶液和樣品溶液,最后開啟復溶鱟試劑,盡可能縮短鱟試劑溶液暴露在空氣中的時間(最好控制在15分鐘內)。酒精棉球擦拭曲頸部將酒精棉球捏干,安瓿曲頸部不要殘留有明顯的酒精,酒精進入鱟試劑安瓿內有很強的抑制作用,同時酒精能溶解凝膠。這也是導致陽性不成立的一個因素。
    綜上所述,作者對細菌內毒素試驗中陽性對照不凝的三個原因進行一一分析,由于作者水平有限以上總結可能不全面,請讀者諒解并提出寶貴意見。
 
(本文完)
作者單位:湛江博康海洋生物有限公司

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