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應用研究
細菌內毒素研究與檢測的臨床應用
Date: 2018-09-18 15:38:17

李秀琴(綜述) 劉津(審校)
(海洋石油總醫院檢驗科,天津300452)
    摘要:長期以來,眾多學者對細菌內毒素進行了大量的研究,取得了一些成果,發表了大量的論著。現已證明細菌內毒素就是革蘭氏陰性細菌細胞壁的脂多糖成分,具有廣泛的生物活性。微量的內毒素進入機體,將會出現發熱、血壓降低、彌散性血管內凝血、內毒素敗血癥等一些列臨床反應。內毒素檢測對鑒別診斷革蘭氏陰性桿菌感染具有重要的參考價值,有助于早期判斷感染類型及是否存在內毒素敗血癥,有利于指導臨床用藥及判斷預后。
    關鍵詞:內毒素;革蘭氏陰性菌;內毒素敗血癥
    內毒素是嚴重威脅人類健康的致病因子,很少劑量的內毒素即能引起極廣泛的生物及病理作用,因而加強內毒素的檢測研究便成為臨床、公衛及藥檢領域的重要課題。隨著檢測方法的研究發展,各種分析技術的交融,更多細菌內毒素檢測方法應運而生。對于內毒素的研究,正向著細胞和分子水平層面發展,我國對這方面的研究尚處于初級階段。隨著對內毒素結構、功能與作用機制認識及檢測方法研究的不斷深入,人類一定能攻克內毒素感染及相關疾病的臨床難題。
    1 細菌內毒素的發現
    細菌內毒素這個概念在1890年就已被提出,它是在研究發熱物質過程中所引起的,1933年由Boivin最先從小鼠傷寒桿菌中提取出來,進行化學免疫學方面的研究。1940年,Morgan使用志賀菌闡明了細菌內毒素是由多糖、脂質及蛋白質三部分組成的復合體。1950年以后,隨著生物學、物理化學、免疫學以及遺傳學等的進步發展,細菌內毒素的研究工作,尤其是其化學機構組成及各種生物活動間的關系也更加明確起來。
    2 細菌內毒素的概念
    細菌內毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁上特有結構,細菌在生活狀態時不釋放出來,只有當細菌死亡自溶或黏附在其他細胞時才表現其毒性,內毒素為外源性致熱源,它可激活中性粒細胞等使之釋放出一種內源性熱源質,作用于體溫調節中樞引起發熱。內毒素的主要化學成分為脂多糖中的類脂A。
    3 細菌內毒素在人體引起的癥狀
    3.1  發熱反應   人體對細菌內毒素極為敏感,極微量(1~5ng/kg)內毒素就能引起體溫上升,發熱反應持續約4h后逐漸消退。自然感染時,因革蘭陰性菌不斷生長繁殖,同時伴有陸續死亡,釋放內毒素,故發熱反應將持續至體內病原菌完全消滅為止。內毒素引起發熱的原因是內毒素作用于體內的巨噬細胞等使之產生白細胞介素1、6和腫瘤壞死因子α等細胞因子,這些細胞因子作用于宿主下丘腦的體溫調節中樞,促使體溫升高發熱。
    3.2  白細胞反應      細菌內毒素進入宿主體內以后,血流中占白細胞總數60%~70%的中性粒細胞數量迅速減少,這是因為細胞移動并黏附到組織毛細血管上了。但1~2h后,內毒素誘生的中性粒細胞釋放因子刺激骨髓釋放其中的中性粒細胞進入血流,使其數量顯著增加,有部分不成熟的中性粒細胞也被釋放出來。由于絕大多數被革蘭陰性菌感染的患者血流中白細胞總數都會增加,所以醫師在診斷前為了初步區別是細菌性感染還是病毒性感染,常常要化驗患者的血液,對白細胞進行總數和分類計數。
    3.3  糖代謝紊亂     在急性內毒素早期先發生高血糖,轉而為低血糖。發生高血糖機制尚不明確,可能與應激反應和糖異生增強有關,從分子水平看,糖異生是內毒素血癥早期能量的重要來源,因為內毒素血癥導致微循環障礙,細胞缺血缺氧,有氧代謝減弱,無氧代謝增強,機體對葡萄糖的需求增加,糖異生增加。大量糖原消耗,可能與腎上腺素大量分泌有關。
    3.4  血管舒縮機制紊亂    內毒素激活了血管活性物質(5-羥色胺、激肽釋放酶與激肽)的釋放。末梢血管擴張,通透性增高,靜脈回流減少,心排血量減低,并可發生休克。因重要器官(腎、心、肝、肺與腦) 供血不足而缺氧,有機酸積聚而導致代謝性酸中毒。
    3.5  其他癥狀    內毒素還能引起早期粒細胞減少癥,以后繼發粒細胞增多癥,活化補體C3,引起由補體介導的各種反應等。
    4   檢測方法
    4.1  家兔檢測熱原法    1942年,美國藥典首先將家兔熱原檢查項收入藥典成為法定方法,中國藥典1953年版開始收藏該方法,隨后世界各國藥典都以動物熱原法作為藥品質量監測的方法之一。這種化驗程序是探測內毒素的高熱活性(發熱誘導)。在實驗兔子的直腸插有溫度計,且兔子感染了含內毒素的實驗溶液(提取內毒素的實驗固體物必須用無熱質消過毒的溶液沖洗)。3h后兔子的直腸檢驗出發熱的跡象。兔子嘗試實驗(也叫熱原試驗)檢測到內毒素的最小濃度為0.1ng/ml。
    4.2  鱟試驗法    1968年,Levin和Bang發現阿米巴樣血細胞含有一種物質,當和極小量的內毒素混合時就變成膠質,這個發現逐漸發展就形成了現在的實驗方法鱟變形細胞溶解產物實驗。鱟實驗法比以往檢測內毒素的方法更便利敏捷,靈敏度高,能檢測出最少300個細菌釋放的內毒素。在藥學、微生物學及臨床檢驗等領域應用較為廣泛。1980年,美國藥典首先收載此法,1995年,中國藥典收載了修訂后的細菌內毒素檢查法,取消了原熱原檢查。2003年,對細菌內毒素定量檢測開始在我國臨床全面開展應用。
    4.3  鱟試驗替代方法的研究      細菌內毒素測定除鱟試驗法外,還有羅氏蛋白染色法、熒光偏振法、碘同位素標記法、酶聯免疫測定法等。應用較多的是酶聯免疫測定法,它是基于抗原抗體酶聯免疫測定法,由外加熱原質刺激巨噬細胞產生的內熱原(如腫瘤壞死因子、白細胞介素1等)而進行測定的方法。
鱟是一種珍稀動物,鱟資源的保護越來越受到重視,對于它的替代方法研究也越來越深入。在日本已經生產出從蠶的體液中提取酶制備的蠶試劑,美國也已在通過基因重組的方法復制鱟試劑酶因子方面獲得了突破。我國現在也應加快開展這方面的研究。
    5  內毒素檢測的臨床應用
    5.1  肝炎   肝炎患者常并發內毒素血癥。甲型肝炎的內毒素血癥發生率為58%,其發病率和內毒素水平均隨著病程的延長而下降,兩者與病程均有非常顯著的意義。乙型肝炎的內毒素血癥發生率與病理類型有關。有文獻報道急性病毒性乙型肝炎發病率占59%,隨著病情的緩解內毒素水平逐漸下降。慢性活動性乙型肝炎時出現內毒素血癥占53. 7%,并且有80%的患者持續存在內毒素血癥。丙型肝炎中的慢性活動性肝炎內毒素血癥發病率高,但血清丙氨酸轉氨酶水平與內毒素血癥發生率及含量無明顯關系。內毒素的水平與病毒性肝炎的病情程度有很大關系。檢測血漿內毒素水平對判斷病情輕重和預后有一定的臨床意義,也為抗內毒素治療作為病毒性肝炎的輔助治療提供了理論基礎。
    5.2  肝硬化   肝硬化并發內毒素血癥十分常見。正常情況下內毒素主要被肝臟的庫普弗細胞所清除。肝硬變后,由于庫普弗細胞清除能力下降或由于肝內組織結構和血流的改變,使內毒素不能與庫普弗細胞充分接觸,門脈高壓側支循環開放,也使內毒素不能在肝內清除或繞過肝臟而進入體循環。肝硬化患者機體免疫功能下降,調理素、IgM等不足或功能減弱,使進入體循環的內毒素不易及時清除,造成嚴重的內毒素血癥。肝臟可提取血流中內毒素的80%~90%,故血中內毒素的升高反過來加重了對肝功能和結構損傷。故肝硬變時高內毒素水平可造成肝功能的進一步損害。
    5.3  膽管疾病  正常情況下來自膽汁的膽酸、膽鹽及分泌型IgA等能抑制腸內菌群的過度繁殖和內毒素的產生。維持黏膜屏障的完整,阻止內毒素的吸收。梗阻性黃疸時,單核巨噬細胞系統尤其是肝臟庫普弗細胞功能受抑,腸道內膽汁缺失使內毒素增大,致內毒素血癥發生率增高。內毒素濃度與梗阻性黃疸的程度(血清膽紅素)以及持續時間有一定關系,與術后并發癥發生率也密切相關。因此,術前檢測內毒素對預測術后病情有一定價值。
    5.4  急性胰腺炎   有文獻報道,急性胰腺炎的輕重程度與血漿內毒素水平呈正相關。急性胰腺炎時,患者伴有不同程度的腸道運動抑制,可致腸道內細菌生長,有害菌數量增加,細菌和內毒素可從腸道源源不斷進入體循環和遠隔器官,導致內毒素血癥和多器官功能衰竭。內毒素還可以誘導巨噬細胞大量分泌腫瘤壞死因子,腫瘤壞死因子是內毒素介導的休克和組織損傷的關鍵介質。急性胰腺炎并發內毒素血癥較為常見,約占66%。值得注意的是死亡病例生前均并發內毒素血癥且持續存在直至死亡。因此,急性胰腺炎早期測定血漿內內毒素有助于判斷疾病的嚴重程度,指導治療。
    5.5  原因不明的發熱   內毒素是一個強力的熱原物質,每毫升血液中達皮克級的內毒素就能使人發熱。免疫低下兒童在診斷和治療上一直存在問題。有文獻報道對一些檢查不出菌血癥和臨床感染的發熱的免疫低下兒童作了內毒素檢查,其結果是所有發熱兒童在發熱期間內毒素水平均高于正常兒童水平,發熱恢復后內毒素含量都降至正常水平。這與Schultz等對成年人進行的類似研究的結果一致。因此,內毒素血癥可能是免疫低下患者原因不明發熱的因素之一。因而血漿內毒素檢測可以發現隱蔽的易被忽略的感染。
    6  小結
    許多研究表明,內毒素與許多感染疾病密切相關,內毒素血癥多隨病情惡化而加重,隨病情緩解而減輕。因此,快速定量檢測各種樣品中的內毒素濃度,對于臨床內毒素血癥早期診斷、合理用藥及藥品檢測具有重要價值。并作為一個衡量病情和判斷預后的參考指標,也可用于指導臨床治療,判斷療效和篩選恰當的藥物。
 
         《醫學綜述》2012年2月第18卷第4期

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